图文导读

1. 单细胞分离技术

1.1显微操作技术

1970年起，Johnstone等开始使用微注射器和微毛细管等工具来进行微生物的显微分选，但由于显微物镜的放大倍率与工作距离之间的相互制约，几乎不能进行单细胞的分离。随着长工作距离、高放大倍率的显微物镜的出现，显微操作技术有了很大的改进，人们可以通过倒置显微镜对放大1000x（包括电子放大倍率）的微生物进行观察，结合精准的压力控制装置，可以准确地放置毛细管以实现对微生物细胞的分离。如今也有商业化的显微操作产品，比如Eppendorf Transfer Man 4R，尽管商业化的显微操作分离产品可以通过更换不同孔径的毛细管来实现对不同尺寸微生物的分离，但需要在多次实验中完成。此外显微操作技术只可以分选液体样本，并不适用于固体样本中微生物的分离，且通量较低，难以实现大规模的微生物分离。

1.2 荧光活化细胞分选

荧光活化细胞分选法(Fluorescence-Activated Cell Sorting，FACS)是一种发展迅速、广泛使用的细胞分选技术。流式细胞仪(flow cytometer)就是以FACS技术为核心，通过流体控制技术使得细胞悬液成单行流动，检测细胞的荧光信息，并通过压电晶体喷出带有不同电荷的液体来包裹每一个细胞，当包裹着细胞的液体流经电场就会偏转到不同的接收装置中。因其具有测量指标多、检测速度快等优点，在临床医学、细胞学、微生物分离等领域的科学研究中发挥了重要作用，但也存在一定局限性。例如，FACS通常要求样品本身具有荧光或对样品进行荧光标记，这需要对目标细胞的表型有预先认知，而未培养微生物通常为完全未知的细胞，难以进行荧光标记；而即便对于那些可以标记荧光的微生物细胞，外源标记也有可能给细胞带来某些影响以至于在实际研究中不能适用。

1.3 微流控分选

基于微流控芯片的分选研究近些年较为热门。微流控分选(Microfluidic isolation)是一种利用微米级的微管道来操控纳升甚至皮升级流体的技术，能够精准控制细胞。目前已经有用于单细胞基因组学、转录组学分析的微流控产品。微流控分选技术的优势在于操作灵活、集成化、速度快等，但由于自然界中的微生物通常形态各异，且含有许多大小不一的微颗粒杂质，在分选时容易发生管道堵塞等问题，限制了此技术在微生物分离培养领域的大规模应用。

1.4 光镊分选

1986年，Ashkin等利用经高数值孔径聚焦的单束激光实现了对电介质微球的三维捕获，标志着光镊技术的诞生。与机械镊子相比，光镊是一种以非机械接触的方式来完成对微小物体的夹持、操纵、捕获和固定，近几十年的发展表明，光镊力的大小在0.1皮牛到几百皮牛范围，光镊技术所使用的光学力具有靶向性和非侵入性，是能够精确操纵生物样本的基础，从几纳米大小的单分子到几十微米的单个微小器官。光镊技术在细胞分离中具有低损伤、可视化等优势，但由于设备操作较为复杂，单细胞分离效率较低，在实际应用中受到一定限制。

1.5 基于激光诱导向前转移技术的细胞分选

激光诱导向前转移技术(Laser-Induced Forward Transfer, LIFT)是一种基于光与物质作用的新型可视化微生物细胞分离技术。其通过成像物镜观察锁定目标细胞，通过弹射物镜将激光聚焦到目标细胞进行弹射分选，控制接收装置配合实现目标细胞的接收。与荧光活化细胞分选等分离技术相比，LIFT细胞分选技术由于是镜下分选，有着更高的显微分辨率，可根据目标微生物细胞的形态、尺寸、荧光及拉曼分子指纹等多种特征进行分选，分选后的细胞能够直接用于扩大培养或全基因组扩增及测序等，单细胞获得率高、适用范围广泛。

图1 细胞分离方法

图2 LIFT不同弹射机理