2021年12月15日，南方科技大学张传伦教授团队的王艺博士应用长光辰英核心产品-PRECI SCS单细胞分选仪在《Analytical Chemistry》杂志上发表了题为“Classification and Identification of Archaea Using Single-Cell Raman Ejection and Artificial Intelligence: Implications for Investigating Uncultivated Microorganisms”的论文，该文章在单细胞水平上研究和分类古菌，为未培养的古菌研究提供了一种有价值的方法。

古菌可以产生特殊的细胞成分，如聚羟基烷酸、类胡萝卜素、视紫红质和醚脂质，这些成分在医药和绿色能源生产中具有宝贵的应用价值。大多数古菌是未培养的，这对研究它们的生物标记物成分和生化特性提出了挑战。在本研究中，我们应用拉曼光谱检测了9种纯培养古菌以及1种未培养古菌的生物学特性，包括嗜盐古菌(Haloferax larsenii, Haloarcula argentinensis, Haloferax mediterranei, Halomicrobium mukohataei, Halomicrobium salinus, Halorussus sp.， Natrinema gari)，嗜热古菌(Sulfolobus acidocalaldarius)和海洋I族(MGI)古菌(Nitrosopumilus maritimus)，以及未培养古菌MGII。拉曼光谱的线性判别分析可以显示9种古菌分离株之间的显著差异。基于支持向量的机器学习分类模型对9种古菌进行分类，准确率达到了88-100%。应用单细胞拉曼分选从混合物中分离细胞，并进行DNA测序分析，预测结果得到验证。利用拉曼光谱和荧光原位杂交技术，获得了未培养古菌(MGII)的拉曼光谱。研究结果表明，MGII可能有能力产生不同于其他古菌物种的脂质。本文在单细胞水平上研究和分类古菌，为未培养的古菌研究提供了一种有价值的方法。

研究思路

1.单细胞拉曼（SCRS）揭示了不同古菌分离株的生物分子特征：拉曼光谱包含单个细胞中独特的生物分子化合物，提供微生物的分子指纹图谱。因此，SCRS可以用于在单细胞水平上对古菌菌株进行分析。为了分析古菌细胞的生理特性，作者获得了经FISH鉴定的9个古菌细胞(简称H1-H7、SCM1和SUL)和海洋细菌细胞(简称ctrl)。并得到其拉曼光谱图谱，显示了每种细胞的特征图谱信息。如图1所示。

图1: 9种古菌和一种海洋细菌的拉曼光谱的均值方差图

2.  LDA分析显示不同古菌和细菌的差异。线性判别分析(LDA)是光谱分析中常用的一种监督分析方法。不同微生物拉曼光谱在LD1和LD2条件可视化显示，LDA结果显示9个微生物组之间存在显著的分离(图2A)。LD1和LD2能解释92.25%的数据差异(LD1为87.17%，LD2为5.08%)。在10组样品中，H2、H4、H5和H6在LD1上相对接近，而在LD2上则明显分离。其他基团在LD1和LD2上均有明显的分离。将每个拉曼谱带对LD1和LD2的贡献绘制成图，以确定在不同菌株之间负责分离的最重要的生物分子(图2B、C)。拉曼波数对LD1的贡献主要是蛋白质和脂类，而对LD2的贡献主要是类胡萝卜素、碳酸氢钠、脂类和蛋白质。

图2：(A) LDA可视化显示不同古菌的差异分类。(B, C)拉曼波数对LD1和LD2的贡献图

3. 不同古菌的机器学习分类和基因组测序鉴定。在生物研究中，支持向量机器学习算法(svm)用于揭示拉曼光谱中的复杂信息，并对细菌进行识别和分类。因此作者利用线性支持向量机算法训练分类模型，并根据9种古菌的拉曼图谱对其进行区分。交叉验证被用来评估SVM模型的能力。结果表明，SVM模型对9种古菌的预测准确率达到了88-100%。（如图3所示）。为了验证SVM模型的预测，我们对7种古菌进行了混合培养。混合培养随机采集拉曼图谱，输入训练模型进行预测。SVM模型预测为H3和H7的细胞通过PRECI SCS进行分选。分选接收的细胞进行全基因组扩增和16S rRNA PCR。凝胶电泳结果显示，全基因组和16S rRNA扩增成功。16S rRNA PCR产物的测序结果显示，分选后的细胞分别为H3和H7，与SVM模型预测的结果一致。结果表明，支持向量机器学习算法能够以较高的准确率应用于微生物的分类和预测。此外，我们的研究结果表明，结合拉曼光谱、机器学习、单细胞分选和基因组测序，不仅可以用于研究纯培养的菌株，还可以用于对混合微生物中的个体进行分类和识别，这对那些未培养的自然微生物的研究尤其有帮助。

图3：应用SVM算法对9种古菌的分类分析

4. Raman-FISH在未培养海洋古菌和细菌中的应用。微生物在海洋地质生化循环中起着重要作用。MGII是海洋中最丰富的异养古菌，积极参与全球海洋碳循环。然而，由于MGII在实验室条件下对富集和培养的抗性，其生化信息存在一定的知识缺口。对未培养的MGII古菌应用拉曼光谱和荧光原位杂交(Raman-FISH)双重方法(如图4)，对海水中MGII古菌和海洋细菌进行FISH成像(图4A、B)，获得MGII和海洋细菌的拉曼图谱(图4C)。由于没有MGII的纯培养物，MGII的拉曼光谱只能在FISH后才能得到。虽然FISH荧光可以引起高背景的拉曼光谱，但随着采集时间的延长，背景的干扰可以被消除。我们的结果与之前的基因组分析一致。MGII被证明具有异养途径，参与代谢多不饱和脂肪酸和其中的甘油磷脂。然而，当分离物和纯培养物可用时，必须验证MGII的脂质特性。然而，我们对MGII的拉曼检测为MGII的脂质组成提供了一个新的视角。总之，不同的生理和功能可以使SCRS有效地分离微生物细胞(图4D)，这可能补充了古菌或细菌的系统发育分类。例如，虽然MGI和MGII都是海洋古菌，但它们被分配到不同的门:MGI被分配到Termoproteota门，而MGII被分配到Termoplasmatota门。MGI是在氮循环中发挥重要作用的自养氨氧化古菌。MGII是浮游异养生物，对古细菌参与海洋碳循环有影响。

图4：（A-B）分别用Eury806探针和Eub338探针对MGI和海洋细菌进行荧光成像。

(C) MGII、SCM1、海洋细菌(MB)和嗜盐古菌(H)的拉曼均值方差图。

(D)基于MGII、SCM1、MB和H的SCRS的LDA可视化。