2022年1月10日，中国科学院广州地球化学研究所李继兵/罗春玲研究员团队与吉林大学张大奕教授、中科院长春光机所李备研究员合作，应用长光辰英公司核心产品-PRECI SCS单细胞分选仪，在《Environmental Science & Technology》杂志上发表了题为“Identifying the Active Phenanthrene Degraders and Characterizing Their Metabolic Activities at the Single-Cell Level by the Combination of Magnetic-Nanoparticle-Mediated Isolation, Stable- Isotope Probing, and Raman-Activated Cell Sorting (MMI SIP RACS)”的论文，MMI-SIP-RACS是一种能够从复杂微生物群落中精确识别并分离菲降解功能微生物的方法，可在单细胞水平上直接将特定功能微生物与其功能和基因型相联系起来。

研究背景

磁性纳米颗粒介导分离-稳定同位素探针技术 (MMI-SIP) 是一种不依赖于培养、具有高分辨率的功能微生物识别技术。该技术主要基于群落水平，因此，无法从单细胞水平直接将微生物与其表型和生态功能相联系。本研究以??C-菲为目标化合物，采用MMI-SIP与拉曼激活细胞分选技术 (Raman-activated cell sorting, RACS) 相结合的新方法（即MMI-SIP-RACS），对多环芳烃 (PAH) 污染水体中降解菲的活性细菌进行探查。结果显示，MMI-SIP-RACS显著富集菲降解菌，成功分离出具有代表性的菲降解功能微生物单细胞。综合SIP扩增子测序、拉曼光谱中单细胞的??C移位以及单细胞测序的结果，证实新鞘脂菌属 (Novosphingobium) 是降解菲的活性菌。此外，MMI-SIP-RACS重构了Novosphingobium的菲代谢途径，识别出了相关的功能基因，包括两个编码菲双加氧酶和萘双加氧酶的新基因。研究结果表明，MMI-SIP-RACS是一种能够精确地从复杂微生物群落中分离活性PAHs降解菌的有效方法，可在单细胞水平上直接将微生物与其功能和基因型联系起来。图一

研究成果

1. 总微生物群落变化：原始污水中的优势细菌主要为Aquabacterium (83.5%)、Zavarzina(6.04%)和Comamonas (5.72%) (如图S2)。然而，在SIP、MFC（magnet-free cell，活性细胞）和MMI-SIP微宇宙中培养3天后，微生物群落结构发生了显著变化。与原始污水相比，SIP和MFC处理中Aquabacterium和Zavarzina的相对丰度显著下降，Pseudomonas (4.58%) 和Azospirillum(4.33%) 成为SIP处理中的优势菌群，Novosphingobium(5.83%) 和Methyloversatilis (32.2%) 成为MFC处理中的优势菌群。此外，在废水中添加MFC悬浮液后，MMI-SIP微宇宙中的微生物组成与SIP处理相比发生了显著变化。特别是Novosphingobium(10.9%)，该菌在MMI-SIP处理中的丰度显著高于SIP处理 (0.45%，p＜0.05)。图S2

2. SIP、MMI 和 MMI-SIP 揭示的菲降解功能菌：MMI微宇宙中（如图2c），MFCs中有4个OTU富集，分别为OTU_2、OTU_5、OTU_12和OTU_3，其REF值分别为5.49、18.4、3.78和55.5。其中，以OTU_2和OTU_5为代表的微生物被鉴定为SIP处理中参与菲降解的功能菌，MMI结果进一步证实了它们在菲原位矿化中的关键作用。然而，根据SIP结果，OTU_12和OTU_3并没有参与菲的降解（如图2a, d)。值得注意的是，以OTU_5为代表的Novosphingobium在MFC（5.83%）中的相对丰度是SIP微宇宙（0.45%）的11.9倍以上，表明MMI显著富集了降解菲的功能微生物（图S3）。在MMI-SIP微宇宙中，3个OTU（包括SIP识别的2个OTU和MMI确定的1个OTU）被确定为菲降解菌，其REF值分别为2.21 (OTU_2)、11.8 (OTU_5) 和2.47 (OTU_12)（如图2a）。显然，与SIP结果相比，MMI-SIP处理中OTU_5和OTU_12的REF值显著增加，表明MMI-SIP识别功能降解菌的分辨率更高。13C-MMI-SIP微宇宙中OTU_5的相对丰度为20.7%，约为SIP处理 (0.14%) 的146倍，REF值为SIP处理的6.19倍。这一结果表明OTU_5所代表的功能微生物显著富集，且为MMI-SIP微宇宙中最活跃的菲降解功能微生物（图2b）。¹³C-MMI-SIP处理中OTU_5的相对丰度 (10.9%) 比SIP微观环境 (0.45%) 高23倍，进一步证实了MMI-SIP对菲降解功能菌的显著富集效果(图S4)。此外， OTU_12并未参与SIP处理中¹³C-PHE的同化，但在MMI-SIP处理中表现出PHE降解能力。根据PHE降解菌的系统发育树图（图S3）， OTU_12属于鞘单胞菌科芽单胞菌属 (Blastomonas)，并且与Blastomonas sp. TW1 (AY704922.1) 和Blastomonas sp. CF7 (AY704921.1) 相似性达99.1%。图S3、图S4

总体而言，SIP能够准确识别菲降解功能菌，但其丰度对于后续的RACS来说相对太低。与SIP结果相比，MMI虽然能够显著富集菲降解菌，但其识别功能菌的准确性有待提高。MMI-SIP结合了前述两种方法的优势，能够证实所鉴定微生物的菲降解功能，并成功将其富集在整个微生物菌群中，这有利于后续通过RACS分离菲降解微生物细胞。

图2

3. 在SCRS光谱中显示??C位移的菲降解微生物细胞的原位鉴定和分离。基于SCRS将参与??C代谢的微生物细胞引起的拉曼谱带显著位移的原理，MMI-SIP-RACS可用于分离废水微生物群落中菲降解菌。如图3a显示，与??C-MMI-SIP处理相比，??C-MMI-SIP微宇宙中某些细胞发生了显著带移。??C-MMI-SIP处理中的微生物细胞在1001和1660 cm^-1处显示出两个拉曼光谱峰，作为未标记细胞的生物标记。它们分别与苯丙氨酸和不饱和脂质的C=C的对称环呼吸模式有关。在??C-MMI-SIP处理中，部分细胞的谱带出现了显著红移，1001cm^-1和1660cm^-1谱带分别偏移到967cm^-1和1624cm^-1（拉曼位移幅度分别为34和36cm^-1），与之前的研究结果一致。因此，这些微生物细胞被认为是同化??C-菲的活性菲降解菌。

利用SCRS在??C-SIP、??C-MMI-SIP和??C-MMI-SIP处理中分别检测了400-1200个细胞。在??C-SIP和??C-MMI-SIP处理中没有观察到谱带从1001cm^-1偏移到967 cm^-1或从1660 cm-?偏移到1624 cm-?的??C标记的细菌细胞。然而，在??C-MMI-SIP微宇宙中，11个单细胞（约占所有检测细胞的1%）表现出相同的??C位移带。我们利用RACS对这些功能微生物细胞进行分选（图3b，c）。根据967、1001、1624和1660 cm-1处的拉曼强度分析（图3d），表明??C-MMI-SIP 处理的微生物细胞与??C-MMI-SIP处理中的非菲降解功能菌细胞之间没有显著差异（p > 0.05）。在??C-MMI-SIP微宇宙中，菲降解功能微生物细胞在967和1624 cm-?处表现出了更高的强度，但在1001和1660cm^-1处表现出较低强度（p<0.001）。以上结果证实，MMI-SIP-RACS可有效富集、识别和分离降解菲的功能微生物细胞。

图3

考虑到单个细胞扩增及获取足够遗传信息的困难，本研究将所有经过MDA处理的细胞进行组合并测序，得到一个没有杂峰的16S rRNA基因序列（1402 bp），这表明排序后的细胞几乎完全相同。经比对发现，分选出的细胞与OTU_5 (100%)、Novosphingobium sp.strain N25 (99.4%)、N. aromaticivorans strain KIT-006 (99.1%) 具有较高的16S rRNA基因序列相似性（图S5），表明所分选出的细胞为OTU_5所代表的菲降解菌Novosphingobium。宏基因组功能图谱 (MFP) 分析显示，与Novosphingobium相关的微生物种群相对丰度高达99.7%，进一步证实了分选细胞的身份。此外，通过单细胞基因组拼接获取了一个完整度高达83.1%的基因组。虽然在组装的基因组中未检测到16S rRNA基因，但鉴定出另一种分子分类标志物gyrB基因。且其系统进化树显示所获得的基因组与N. aromaticivorans (wp_0114469477.1) 和N. aromaticivorans (SCY28706.1) 的亲缘关系最密切，相似性达100% （图S6）。图S5、图S6

4.菲降解菌基因型与功能的连接及菲代谢途径的重建。根据KEGG数据库，对所分选的菲降解微生物代谢信息进行分析，并将其与基因型进行了关联。本研究共检测到22种功能类别，其中碳水化合物 (15.6%)、辅助因子和维生素 (12.8%)、氨基酸 (12.6%)、脂类 (10.1%)、萜类和聚酮类 (8.02%)和外源性物质 (6.94%) 的相对丰度较高（图S7a）。在相对丰度最高的碳水化合物代谢中，检测到与13个功能类别相关的基因（例如，丁酸、丙酮酸、丙酸、乙醛酸和二羧酸的代谢），这表明分类后的细胞可以将这些物质用作碳源（图S7b）。此外，一些基因参与了微生物生长和培养的重要物质辅助因子和维生素的代谢，包括维生素B1、B2、B3、B6、B7、B9和硫辛酸（图S7c）。虽然已鉴别出一些与外源生物降解和代谢相关的功能类别，包括芳香族化合物（如氨基苯甲酸盐、苯甲酸盐、双酚和氯苯）的生物降解，但在已分类的菲降解细菌细胞中未检测到PAH降解的亚类别（图S7d）。然而，根据GhostKOALA注释结果，参与菲降解的萘/水杨酸代谢途径中相关的功能基因被检测出，如编码2-羟基色胺-2-羧酸异构酶 (NahD)、反式-羟基苄基丙酮酸水合酶 (NahE) 和水杨酸羟化酶 (NahG) 的基因。基于AromaDeg数据库，鉴定出与菲双加氧酶（Phn）、萘双加氧酶 (Nah)、1,2-二羟基萘双加氧酶 (Dhn) 和水杨醛脱氢酶 (Sal)相关的功能基因。结合这两个数据库的分析结果，可直接将菲降解菌Novosphingobium的功能与其基因型相联系，并成功为所分选的细胞绘制出一个较为完整的菲代谢途径（图4）。图S7图4

结论

通过耦合MMI、SIP和RACS，即MMI-SIP-RACS技术，可从污染水体中识别并分离活性PAHs降解功能微生物细胞。本研究中，MMI成功富集了菲降解菌，SIP验证了其功能，RACS进一步利用拉曼光谱识别出功能微生物细胞并将其分离，在单细胞水平上将特定功能微生物与其功能和基因型相联系起来。本研究表明，MMI-SIP-RACS是一种强大的未培养方法，可在复杂群落中有效识别、分选出活性PAH降解菌，并在单细胞水平上连接它们的基因型和功能。同时，该技术也可分离真实环境中参与其他有机污染物矿化的活性降解菌细胞，并对有机污染物的原位生物降解机理提供新的认识。

文献链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.1c04952?goto=supporting-info