2022年11月，中科院长春光机所李备研究员团队与江南大学陆震鸣教授团队应用长光辰英核心产品——P300共聚焦拉曼光谱仪在《Talanta》期刊上发表了题为“Multi-point scanning confocal Raman spectroscopy for accurate identification of microorganisms at the single-cell level”的论文。本研究提出了一种多点扫描共聚焦拉曼光谱技术，用于建立更可靠的微生物单细胞拉曼光谱数据库，更准确地进行微生物分类和识别。

一、研究背景

拉曼光谱已经广泛用于微生物单细胞分析。众所周知，即使是微米级的单个微生物细胞也包含不同功能的分子结构，如拟核、核糖体、质粒、间体等，它们在细胞内随机分布，即微生物存在空间异质性。微生物的大小各不相同，而获取拉曼信号的激光光斑的大小通常是恒定的，并且细胞的拉曼光谱是激光焦点内所有生化成分的光谱信息的叠加。因此当微生物尺寸大于激光光斑尺寸时，从细胞内单点测量的拉曼光谱不能收集到所有的生化成分信息，这会影响微生物识别的准确性。

二、研究内容

在本研究中，提出了一种利用多点扫描共聚焦拉曼光谱技术。通过图像识别算法和高精度位移台的控制，拉曼光谱可以一次曝光时采集微生物内多点生化成分信息，以便充分表征微生物单细胞内的成分信息。这就解决了被测微生物单细胞大小不一而共聚焦拉曼系统的激光光斑不易改变的问题。然后分别测量三种大肠杆菌和七种乳酸菌的单细胞拉曼光谱，采用常用的监督分类方法对单点光谱和多点扫描光谱的数据进行比较，多点扫描光谱在准确率和召回率方面都表现出更好的性能。

图1. 微生物单细胞多点扫描拉曼光谱采集及分析流程图

（1）首先为了从拉曼光谱的角度验证微生物的空间异质性，采集了三种微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌）单细胞的mapping数据。图2表明不同空间位置的微生物拉曼光谱由于其空间异质性而有细微差异。由于不同的微生物表型具有独特的分子组成，但这些差异在拉曼光谱中是微小的，并且亲属之间越接近，差异越小。因此，由于微生物的空间异质性，拉曼光谱的细微差异会影响微生物识别的准确性。

图2. 三种微生物的mapping图像及四个位置的拉曼光谱

（2）由于选择测试的细菌长度为2~5μm，激光光斑尺寸约为1μm，为了使光斑覆盖整个细菌，多点扫描拉曼光谱选择测试点数为5。使用600g/mm光栅分别采集了七种微生物的单点光谱和五点扫描光谱数据，两类数据采集条件均相同，采用支持向量机（SVM）对两类数据进行比较。结果表明，五点扫描光谱数据中各种细菌的召回率均高于单点光谱数据，五点扫描光谱数据的召回率均大于90%。单点光谱数据和五点扫描光谱数据的整体识别准确率分别为94.1±2.6%和97.6±1.7%，五点扫描光谱数据识别准确率提高了约3.7%。因此，五点扫描光谱数据模型的分类性能优于单点光谱数据模型。使用1200g/mm光栅分别采集了四种微生物的单点光谱和五点扫描光谱数据，也同样得到了此结果。

图3. 使用600 g/mm光栅采集的6种微生物的单点光谱数据（a）和五点扫描光谱数据（b）的SVM混淆矩阵

图4. 使用1200 g/mm光栅采集的4种微生物的单点光谱数据（a）和五点扫描光谱数据（b）的SVM混淆矩阵

三、结论

为了解决微生物的空间异质性问题，文中提出了基于图像处理技术的多点扫描共聚焦拉曼光谱技术，并使用SVM分类识别算法比较了传统的采集方法和多点扫描采集方法。与单点拉曼光谱相比，多点扫描共焦拉曼光谱具有较高的召回率（达到90%）和识别准确率（~96%）。结果表明，多点扫描共焦拉曼光谱可以充分表征细胞内的全部生化成分信息，使拉曼光谱成为单个细胞真正的 "指纹光谱"。与广泛的统计分析方法相结合，能够建立更可靠的微生物拉曼光谱数据库。因此，多点扫描共聚焦拉曼光谱在微生物的准确识别和分类方面有很大的潜力，有利于微生物学各领域的发展。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.talanta.2022.124112