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2024年6月15日，上海理工大学刘箐教授与山西师范大学晋程妮、闫帅帅团队在《Foods》期刊上发表了题为“Raman-Activated Cell Ejection for Validating the Reliability of the Raman Fingerprint Database of Foodborne Pathogens”的论文，该研究通过拉曼检测结合机器学习算法预测了食源性病原菌类型，并通过单细胞分选结合16s鉴定及宏基因组测序技术验证了该方法预测的准确性。长光辰英核心产品——P300激光共聚焦拉曼光谱仪及PRECI SCS微生物单细胞分选仪有幸为本研究中食源性病原菌的检测及分选验证提供了有力工具。
由病原体感染的食物和水引起的食源性疾病，已经成为人类健康面临的最大挑战之一。而传统的食源性病原体的检测策略相对来说较为耗时费力，通常需要漫长的细菌浓缩过程。因此，开发一种能够在食品受污染早期快速诊断病原体的食源性病原菌检测方法迫在眉睫。拉曼光谱检测作为一种高分辨率非侵入性的检测手段，能够实现在单细胞水平上的食源性病原体检测而不需要对实际样品中的细菌进行预浓缩。拉曼光谱的快速检测配合机器学习算法已被用于其他样品的物种建库与预测，但该方法对预测效果的有效性有待进一步探究。
该研究为评估拉曼检测联合机器学习模型在食源性病原菌识别分类中的有效性，采用了不同机器学习模型进行比较，后又通过激光诱导向前转移技术（LIFT）对混合样品进行单细胞分选，进而确定其实际的物种类型，验证预测的准确性。将4种不同的常见食源性病原菌（大肠杆菌ATCC 43895、副溶血性弧菌ATCC 33847、李斯特菌ATCC 19115、金黄色葡萄球菌ATCC 29213）进行拉曼检测建库，并比较了3种机器学习算法的预测准确率，选择了准确率最高的分类模型对4种菌的混合菌液进行了识别分类。接着，通过单细胞分选技术将预测为同类型的单细胞收集在一起，通过16s rDNA测序和宏基因组测序验证预测细胞的物种信息是否与预测一致。
图1 分选扩增验证拉曼检测与机器学习预测结果准确率流程图
选取了4种常见的食源性病原菌，包括大肠杆菌ATCC 43895、副溶血性弧菌ATCC 33847、李斯特菌ATCC 19115及金黄色葡萄球菌ATCC 29213（2种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌）。对4种菌进行拉曼检测，并利用HOOKE IntP线下分析软件进行了预处理，图2A为4种菌的平均光谱。先前的研究表明，540cm-1和1421cm-1为肽聚糖的可见峰，1087cm-1为磷壁酸的典型峰，革兰氏阳性菌较革兰氏阴性菌拥有更多的肽聚糖和磷壁酸。对3个峰位处的拉曼光谱峰强进行了统计，发现拉曼光谱结果与实际菌的表型是相符的（图2B）。
图2 4种常见食源性病原菌的平均光谱与峰强统计
A为金黄色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌与大肠杆菌（从上到下依次，并不代表峰强）预处理后的平均拉曼光谱；B为4种菌在3个峰位处的峰强统计。
接着对4种菌进行拉曼建库后，分别采用支持向量机（SVM）、K近邻算法（KNN）以及线型判别分析（LDA）的方法对预测数据集进行物种预测。结果显示，3种方法中SVM模型的准确率最高（图3），且ROC曲线最好，因此后续采用SVM模型进行预测。
图3 3种机器学习模型对4种食源性病原菌预测集的分类准确率
2. 混合菌物种预测与验证
将上述4种食源性病原菌混合在一起后，进行拉曼检测，随机选择单细胞光谱，利用SVM预测其物种，并对预测为同种菌的单细胞分选在一起，扩增基因组DNA，然后进行16s rDNA验证扩增结果，16s测序与宏基因组测序验证人工智能模型识别的病原菌是否正确。16s rDNA验证结果显示，20组实验中有12组成功分选扩增。对应的测序结果显示，12组成功分选扩增中有10组的物种组成与SVM模型预测一致，剩余2组可能在基因组扩增过程中受到环境影响导致了4种病原菌外的污染（图4），因此，最终确定SVM模型的预测准确率为83.3%。
图4 基于分类模型的上游预测与基于基因组测序的下游验证的比较
高质量的基因组DNA扩增产物在16S rRNA扩增产物的凝胶电泳图中表现出特定的明亮条带，这些扩增产物来自单细胞分选后的细胞。1~5为大肠杆菌，6~10为副溶血性弧菌，11~15为单核细胞增多性李斯特菌，16~20为金黄色葡萄球菌，N为阴性对照。
综上所述，利用拉曼检测与单细胞分选技术将食源性病原菌的表型与基因型串联，验证了拉曼指纹数据结合机器学习模型预测食源性病原菌的可靠性，该方法能够快速、无损、高灵敏地实现食品污染中食源性病原菌的快速诊断与鉴定，为保障食品安全，减少食源性疾病的发生提供了一种具有广泛应用前景的技术手段。
文章链接：
本研究将长光辰英自主研发的P300共聚焦拉曼光谱仪与PRECI SCS微生物可视化单细胞分选仪联用，在单细胞层面上成功搭建了食源性病原菌表型与基因型间的桥梁。
首先，凭借P300高灵敏度、高稳定性的拉曼光谱采集特点，为食源性病原菌单细胞在短时间（1s）内实现快速检测提供了可能。
随后，基于激光诱导向前转移技术（LIFT），不仅对拉曼识别到的微生物单细胞实现了快速、精准地分选，而且与全基因组扩增及测序技术相结合，在本文食源性病原菌的检测与分类验证过程中起到了核心作用，实现了对食源性病原菌表型与基因型特征的有效对应。
这对揭示病原菌的生物学特征和基因代谢机制具有重要意义，为食源性病原菌的快速诊断和防控提供了新的视角。
闫帅帅，博士，山西师范大学食品科学学院，硕士生导师，主要从事食品污染源危害控制，主持省部级项目1项，参与国家重点研发项目2项，发表SCI论文10篇。
刘箐教授，博士，上海理工大学健康科学与工程学院三级教授，硕士、博士生导师，食源性致病菌危害与控制研究所所长，主要从事食品安全及医学临床等生物靶标的快速检测，肠道菌群生物大数据解析与疾病早期诊断基础与应用研究。2011年入选国家高层次人才计划；主持（参与）国家重点研发计划、国家自然科学基金等国家和省部级科研项目30余项；已发表科研论文200余篇，持有国家发明专利30余项，获省部级自然科学奖、科技进步奖一、二等多项。建立了我国第一个病原细菌单克隆抗体库；自主研发了“肠道菌群宏基因组大数据自主分析平台”；建立了“中国病原细菌菌种库”(China Pathogenic Bacteria Collection, CPBC)；正在构建的人类肠道菌群元基因组数据库（Human Intestinal Flora Metagenomic Database, HIFMD）。
0431-81077008
