用户文章丨《Nature Food》中国科学院城市环境研究所团队发表基于单细胞分离技术的土壤原生解磷菌原位活性检测新方法

2024-09-12 14:30:58

2024年8月5日,中国科学院城市环境研究所朱永官院士和崔丽研究员团队在《Nature Food》期刊(IF23.6)发表了题为“Single-cell exploration of active phosphate-solubilizing bacteria across diverse soil matrices for sustainable phosphorus management”的论文,文章第一作者为李弘哲副研究员。文章采用单细胞拉曼重水(Raman-D2O)标记技术对土壤原生活性解磷菌(PSB)进行了识别和定量,并通过宏基因组及高通量测序方式确定了土壤中活性解磷菌的主要代谢途径。其中,长光辰英核心产品——PRECI SCS微生物单细胞分选仪为高活性土壤解磷菌的筛分提供了快速、便捷的分离工具。 

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一、研究背景

磷是所有生物的基本元素,其有限的全球储量强调了农业系统中有效磷管理的重要性。目前,地质磷矿的不可再生性、磷肥需求的增加和利用效率的低下导致了磷危机,危及全球粮食生产。解磷菌(Phosphate-solubilizing bacteria, PSB)通过分泌有机酸和磷酸酶来提高磷的生物利用度和调节磷的转化过程。它们在原生土壤环境中的代谢活性显著影响了土壤固定磷的溶磷效率。了解PSB的原位活性及其对不同土壤和施肥类型的响应是指导有效施肥的基础。将这种活性与特定的分类群和遗传决定因素结合起来,可以更全面地理解磷溶解过程的机制,并为可持续的磷管理提供见解。

二、研究方法


在该研究中,为了量化土壤中PSB的原位活性及其对土壤类型和施肥的影响,选择了三个地区(德州DZ、东湖DH、祁阳QY)的土壤并施加两种不同类型的肥料(无机肥IF、无机肥+有机肥CF),对9组样品(含三个地区土壤不添加肥料的对照组CK)进行了土壤理化性质检测。为筛选土壤中原生高活性PSB,先对各组土壤进行了溶解性游离磷的去除,接着采用Raman-D2O法标记其中的高活性PSB。该方法的原理是,在去除游离磷的土壤中,只有具备土壤固定磷代谢能力的PSB才能够同时代谢D2O,被D元素标记,进而量化其活性。然后通过单细胞分选仪对高活性的PSB进行分离,经过宏基因组与高通量测序探究其磷代谢相关过程的基因。另外,由于微生物的碳代谢过程会影响PSB的磷代谢活性,因此对碳代谢功能相关的基因也进行了关注。最后,通过盆栽实验确定了PSB对土壤固定磷释放的影响。

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图1 Raman-D2O标记筛选高活性PSB流程图

三、结果


1. 土壤微生物原位溶磷能力的定量

首先,对方法中提到的9组土壤去除原有的溶解性游离磷,将处理过的土壤与重水进行共孵育,具有土壤固定磷代谢活性的PSB在拉曼光谱检测中呈现较为明显的C-D峰(2040-2300cm-1)。由于土壤活性PSB的C-D比会随着土壤类型和施肥处理的不同而产生差异,因此,每组C-D比采用标准化C-D比进行组间比较,标准化C-D比:洗涤土壤的C-D比/原始土壤C-D比的平均值。三种土壤在不同施肥条件下的PSB活性如图2a所示,标准化C-D比高于图中横线所示阈值(0.5)的个体视为活性PSB。另外,对9组样品中的活性PSB丰度进行了统计(图2b),结果发现,IF的施用能够促进DH和DZ土壤中活性PSB的丰度,而在QY土壤中,IF和CF的施用都使得活性PSB丰度略有下降。将PSB活性与活性PSB丰度相乘以量化土壤微生物的磷溶解效率(图2c),结果发现,磷溶解效率的总体趋势与活性PSB丰度趋势相似,但标准差更大,说明这些土壤中单个PSB细胞活性变化很大,有必要对土壤高活性PSB进行定向分离。

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图2 Raman-D2O标记土壤活性PSB统计

图a为三种土壤不同施肥条件下各菌的磷代谢活性统计;图b为9组样品中活性PSB丰度统计结果;图c为PSB代谢活性与PSB丰度相乘得到的土壤磷溶解效率


2. 高活性原生PSB的定向分类和物种鉴定

经过上述拉曼检测后,采用PRECI SCS微生物单细胞分选仪,基于激光诱导向前转移(LIFT)单细胞分选技术,对高活性PSB单细胞进行分选,并将分选细胞用于16s rRNA测序和宏基因组检测。在该过程中每种土壤中选择了20个高活性PSB(H-PSB),共60个H-PSB单细胞。通过分选前后的16s rRNA扩增子测序结果显示,H-PSB的门在除磷后的原始土壤中普遍存在(图3a)。最终统计结果确定,在物种水平上被分类的高活性PSB包括DH土壤中的Bacillus marmarensisBacillus pseudofirmus,DZ土壤中的Moraxella osloensis,和QY土壤中的Stenotrophomonas maltophiliaCutibacterium acnes (图3b)。

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图3 分选前后16s rRNA测序检测物种差异

图a为分选前后16s rRNA测序物种差异统计;图b为三种土壤中高活性PSB物种统计


3. 宏基因组揭示土壤PSB磷碳循环相互作用遗传基础与代谢途径

为了进一步了解磷增容功能的遗传基础和相关的代谢途径,对分选的单细胞进行宏基因组测序,得到磷溶解相关功能的基因。将宏基因组检测到的基因在NCBI和KEGG中进行了功能解读与注释,确定分选的H-PSB中鉴定到了磷溶解、矿化、调控功能和转运体相关的基因(图4a),这表示这些细菌拥有完整的遗传途径参与解锁固定磷。同时,在所有分类的H-PSB群落中都检测到了编码碳底物降解酶的基因,说明H-PSB的碳代谢能够加速无机磷的溶解过程(图4b)。

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图4 分选的H-PSB遗传信息

图a为7个H-PSB的系统发育树及基于NCBI数据搜索得到的H-PSB中与磷循环相关的功能基因热图;图b为检测到的参与纤维素、半纤维素、木质素、淀粉和果胶降解的CAZyme基团;

图c为碳代谢和三羧酸代谢的概述,彩色方块代表功能性基因或酶的存在

四、结论


本研究为量化土壤微生物的磷溶解效率,在去除溶解性游离磷的土壤条件下,提出了一种基于单细胞Raman-D2O技术的PSB识别定量方法,用以量化不同土壤中原生PSB的活性和丰度,又结合单细胞分选技术和靶向宏基因组测序,提供了一种将土壤PSB的磷溶解功能与其物种以及潜在机制联系起来的方法。揭示了PSB在土壤中的原位溶磷行为以及土壤关键PSB类群中磷碳循环基因之间的直接联系,为指导磷肥使用或农业肥料应用提供了可靠的理论基础。

文章链接:https://www.nature.com/articles/s43016-024-01024-8

五、辰英价值


该研究中采用的PRECI SCS微生物单细胞分选仪是长光辰英自主开发的一款基于LIFT技术,应用于微生物单细胞可视化分离的科研级分选仪。在本文中,单细胞拉曼分选提供了一种将土壤高活性解磷菌的原位表型与基因型联系起来的新策略。PRECI SCS微生物单细胞分选仪在该方法中起到了关键的分离作用,其可视化、准确、快速、特异性分选的特点,为实现功能微生物表型与基因型的一致性评估提供了有力工具。

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六、研究团队


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朱永官院士

生态环境学家,中国科学院院士,发展中国家科学院院士;长期从事环境土壤学和环境生物学研究。现任中国科学院城市环境研究所/生态环境研究中心研究员。曾任国际原子能机构科学顾问(2004-2012),现任国际期刊Environment International共同主编以及多个国内外学术期刊的副主编和编委。在国际上发表学术论文500余篇,包括多篇发表在Science, Nature及其子刊。2016-2020年连续五年入选科睿唯安(Clarivate Analytics)全球高被引科学家。

 

崔丽

中国科学院城市环境研究所,研究员,博导,国家优青。厦门大学学士和博士,英国牛津大学、兰卡斯特大学和瑞士伯尔尼大学访问学者。长期从事环境微生物单细胞拉曼新技术研发,并研究原位复杂环境中抗生素耐药性、病原菌、以及固氮和解磷等有益功能菌。已在PNAS,Angew,JACS,PNAS nexus,EST,Anal Chem等发表论文70余篇,应邀在Anal Chem和Trends in Anal Chem发表拉曼研究微生物的方法综述。担任美国微生物学会旗下杂志mSystems编辑,Chinese Chem lett、环境化学等编委。主持NSFC国家优青基金、微塑料专项项目、重大研究计划,以及中国科学院从0到1原始创新项目等10余项,参与NSFC创新群体研究项目。

 

李弘哲

中国科学院城市环境研究所,副研究员。华中农业大学农业资源与环境专业学士,中国科学院城市环境研究所环境科学博士。长期从事环境活性微生物、单细胞技术、抗生素耐药性等领域研究。已在PNAS,Environmental Science & Technology,Analytical?Chemistry等期刊上发表高水平论文。主持青年科学基金项目、国家重点研发项目子课题等项目。

 

 



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